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- 有几种方法可以选择：1.EMSA：一般都是用P标记的探针，具有放射性，要是用生物素标记的话，放射性就小了，但是花的钱就多了。最重要的是放射性的问题，必须有磷屏，否则没法做。2.western blot： 这个抗体应该用磷酸化的P65抗体，，因为只有磷酸化的蛋白才具有活性，你要是有钱的话，可以连总蛋白和磷酸化蛋白一起做，比较完善。3.免疫组化： 也是可以的，原理跟western blot差不多。4.双荧光素酶：还有一种更好的方法就是promega的双荧光素酶报告系统，采用海肾和萤火虫两种荧光素酶，一种报告目的基因，一种报告内参，很好的方法，但是很贵。总体来说，做EMSA和双荧光素酶是最好的方法，算是定量，但是EMSA有放射性，双荧光素酶比较贵。western和免疫组化只能用来半定量，但是做的人比较多，也能发高水平的杂志，相对来说比较简单，也省钱。
- 2022-01-12 05:35:18
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- 荧光素酶报告基因荧光素酶报告基因系统是用于检测萤火虫氟化烯（用荧光素酶活性的萤火虫酶活性作为底物的报告系统。中名荧光素酶报告基因外来荧光素酶底物醛纤维（Luciferin）生物氟化物生物发光转录因子变量因子转录因子检查荧光素酶报告基因系统是荧光素作为底物的用于检测萤火虫氟化烯（萤火虫酶活性）的报告系统。荧光素酶可以将荧光素氧化催化到氧化昔粒素中，这将在荧光素氧化过程中产生生物荧光。然后可以通过荧光测定或荧光剂（发光器）或液体闪光测量来测量荧光素氧化期间释放的生物荧光。通过基因的表达，荧光素和荧光素酶的生物发光系统可以非常敏感和有效地检测。它是检测转录F的检测方法作用者和目的基因启动子区DNA DNA。应用原理转录因子是具有特殊结构的蛋白质分子，锻炼调控基因表达的表达，也称为输血因子。一些转录因子仅粘合到其靶起子中的特定序列，并且这些特定序列被称为顺式作用元件，并且转录因子的DNA结合结构域共价键合，从而抑制基因的表达。或增强效果。荧光素酶测定是检测此类转录因子及其目标启动器中特定顺序的重要手段。简要描述原理如下：（1）构建靶起子特定片段的报告，进入报告质粒，例如PGL3-碱等。（2）用报道基因组质粒用293个细胞或其他相关细胞系转染要检测的转录因子。如果转录事实R能够激活靶起始，表达荧光素酶基因，并且荧光素酶的表达量与转录因子的强度成比例。（3）添加特定的荧光素酶基质，荧光素酶和底物反应，产生荧光，并通过检测荧光的强度来确定荧光素酶的活性，确定转录因子是否可以用该靶促进剂片段起作用。。技术流程（1）通过生物信息学方法分析和预测启动子区的可能的转录因子结合位点。（2）设计引物PCR方法从基因组DNA插入基因组DNA所需的目标起动器子部分，将片段插入荧光素酶报告基因组质粒（PGL3-碱）中。（3）筛选阳性克隆和测序。扩增克隆和纯等离子体。（4）转录因子扩增，繁殖。在萨姆e Time，制备相应的空气负荷质粒对照，备用备用。 （5）培养培养293（或其他目的细胞）并在24孔板中接种，生长10-24小时（80％组装）。 （6）将转染的细胞报告给转录因子表达质粒。 （7）提取蛋白质并用于荧光素酶检测。 （8）加入基材并测量荧光素酶的活性。 （9）计算相对荧光强度并与空载控制进行比较。荧光素酶报告基因测试的发展：结合萤火虫和海绵荧光荧光先进的总报告基因试验技术在表达荧光芴酶时，通常用于减少实验的变化因子。然而，传统的普通记者（如猫，β-加仑，GUS）不方便，因为它们各自的测试化学，治疗要求检测特征是不同的。 PR.Omega提供先进的双重报道基因技术，结合萤火虫荧光素酶测试和海洋Cavollanmia测试。双荧光素酶报告基因测试系统，结合PRL载体系统，表达第二次报告基因海洋气孔酶，进行荧光素酶报告基因测试，快速，敏感，单管中简单。该系统还提供PLB裂解物，以裂解在多孔板中培养的哺乳动物细胞而不操作单个样品。正在报告萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因检测系统将使它们感觉到系统的便利性。额外的分泌荧光素基因：目前，NEB提供了新型的荧光酶，其可以分别是Gluc和Cluc的细胞外分泌的荧光素酶，并且可以在NEB的官方网站上找到特定的使用。
- 2022-01-12 05:34:12
- 萨满祭司
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- 2022-01-12 05:34:12
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